Чикагская согласительная конференция по сепсису

Клинически сепсис характеризуется наличием первичного инфекционного очага, бактериемии, множественных вторичных очагов-отсевов с практически непредсказуемой локализацией, ацикличностью течения инфекционного процесса. Развитие сепсиса у пациента ассоциируется с тяжелым клиническим течением болезни, труднопредсказуемым исходом и высокой летальностью.

Наблюдаемый в последние годы рост частоты случаев сепсиса обусловлен следующими факторами:

Ключевую роль в развитии сепсиса играет взаимодействие микрофлоры и макроорганизма: с одной стороны, изменение патогенности бактерий при их колонизации в ранах, на ожоговых поверхностях, на катетерах и т.д., с другой — развивающиеся у пациента иммунодефицитное состояние и иммунный паралич.

По вопросам определения и классификации сепсиса, механизмов его развития, лечения этого тяжелого заболевания у представителей разных медицинских специальностей существует большой разброс мнений. Во многом эта ситуация объясняется отсутствием у патологов единой точки зрения на сущность происходящих при сепсисе процессов, а также определенной нестыковкой смыслового наполнения представлений о заболевании у клиницистов и патологоанатомов.

С целью преодоления указанных противоречий на согласительной конференции американского Колледжа пульмонологов и Общества специалистов критической медицины в Чикаго [ACC/SCCM Consensus Conference Committee, 1991 г.] предложены определение, классификация и критерии клинической диагностики сепсиса, обсуждены вопросы его этиологии и патогенеза, разработаны рекомендации для лечения.

Синдром системного воспалительного ответа

Синдром системного воспалительного ответа (ССВО, Systemic Inflammatory Response Syndrome — SIRS) — это системный воспалительный ответ на повреждение тканей инфекционной или неинфекционной природы, сопровождающийся гиперпродукцией провоспалительных цитокинов и медиаторов.

Развитие ССВО констатируют при наличии двух или более из следующих симптомов:

• гипер- или гипотермия: температура тела выше 38°С или ниже 36°С;
• тахикардия более 90 уд/мин;
• тахипноэ: частота дыхания более 20 в минуту или рСО2 ниже 32 мм рт. ст.;
• лейкоцитоз или лейкопения: число лейкоцитов более 12 х 109/л или менее 4 х 109/л либо появление более 10% незрелых (палочкоядерных, юных) форм.

Признаки инфекционной природы ССВО:

• устойчивая бактериемия (идентичная флора);
• наличие не санированного обширного очага воспаления (не всегда);
• наличие устойчивых лабораторных признаков инфекционно-воспалительной альтерации при убедительном исключении местного деструктивного процесса.

ССВО может не только быть проявлением сепсиса, но и отражать высокую готовность макроорганизма к его развитию.

Согласно дефиниции, предложенной ACC/SCCM (1992) и широко распространенной в настоящее время в зарубежной литературе, сепсис представляет собой ССВО при выявленном очаге инфекции.

Тяжелый сепсис характеризуется наличием одной из форм органно-системной дисфункции (респираторный дистресс-синдром взрослых, кардиогенная недостаточность кровообращения, острая почечная недостаточность, ДВС-синдром и т. д.) при наличии установленного сепсиса.

Выделение в клинической классификации ССВО — вынужденная мера, так как в первые часы правильная диагностика заболевания затруднена, данные лабораторных и бактериологических исследований запаздывают, а пациент нуждается в лечении.

Развитие ССВО могут вызвать биологические (бактерии, грибы, вирусы, паразиты), физические (излучение, травма), иммунологические (аутоиммунные и иммуно-комплексные заболевания), химические или метаболические (гипоксия, нарушение метаболизма) факторы. В качестве примеров можно привести следующие патологические состояния, при которых может развиваться ССВО, — панкреатиты, обширные травмы, ожоговая болезнь, массивные кровоизлияния, распад опухолей и т. п.

Синдром полиорганной недостаточности

В предложенной Чикагской согласительной конференцией АСС/ SCCM (1992) классификации выделяют стадийность заболевания, коррелирующую с исходом: сепсис, тяжелый сепсис и септический шок. Основным отличием сепсиса от тяжелого сепсиса является отсутствие функциональных органных расстройств.

В свою очередь, для тяжелого сепсиса характерно появление признаков органно-системной дисфункции, которые могут нарастать и сопровождаться формированием выраженной декомпенсации с развитием синдрома полиорганной недостаточности (СПОН, Multiple Organ Failure Syndrome — MOFS).

СПОН — это клинический синдром прогрессирующей, но потенциально обратимой дисфункции двух или более органов (систем) с угрожающими нарушениями гомеостаза. Самостоятельное, без лечения, поддержание гомеостаза невозможно.

СПОН сопровождается системными нарушениями тканевых механизмов жизнеобеспечения, имеющими в своей основе дезорганизующий эффект медиаторов воспаления в условиях редуцированной перфузии тканей. Возникает неспособность поддерживать адекватный гомеостаз организма на органно-системном уровне. СПОН, по существу, представляет собой крайнюю степень выраженности ССВО.

Оценка тяжести состояния больных с сепсисом проводится по распространенным балльным шкалам оценки состояния пациента APACHE-II или SAPS-II, что позволяет объективизировать тяжесть течения заболевания с учетом возраста больного и наличия сопутствующей патологии. Оценка тяжести СПОН осуществляется по критериям A. Baue et al. (2000) или по шкале SOFA.

Для оценки ССВО и СПОН разработана система PIRO, которая характеризует предрасположенность к инфекции (Р), описывает особенности этиологии и локализации первичного очага (I), системную реакцию организма (R) и наличие органной дисфункции (О).

Септический шок, помимо СПОН, сопровождается развитием артериальной гипотензии, не устраняемой с помощью инфузионной терапии (адекватной коррекции гиповолемии) и требующей использования вазопрессоров.

По длительности заболевания достаточно условно выделяют сепсис:

• молниеносный (до суток или до 3 суток, также называемый острейшим);
• острый (до 2—3 или до 6 недель);
• подострый или затяжной (более 3 или 6 недель); подострым также считают сепсис давностью 2—12 недель, а затяжным, рецидивирующим — от 12 недель до нескольких лет.

Механизмы развития любого инфекционно-воспалительного заболевания, включая сепсис, являются результатом взаимодействия патогенов и макроорганизма. В зависимости от патогенных свойств возбудители делят на 4 класса.

Высокопатогенные возбудители I—II классов вызывают развитие острых инфекционно-воспалительных заболеваний, характеризующихся цикличностью течения. Факторы вирулентности возбудителей этих классов представлены главным образом инвазинами и экзотоксинами. Сепсис является гено-фенотипически обусловленным ациклическим заболеванием, вызванным бактериальной микрофлорой III—IV классов патогенности (условно-патогенной).

Для современной клиники дифференциальный диагноз между ССВО, вызванной инфекцией и другими, неинфекционными, причинами, представляет существенные трудности. Кроме того, клинические методы оценки тяжести ССВО и прогноз пока разработаны недостаточно.

Перспективен поиск иммунологических маркеров, которые позволили бы отличить ССВО инфекционной и неинфекционной природы и прогнозировать течение заболевания. В настоящее время проводятся исследования прогностической значимости содержания в периферической крови апоптотически измененных клеток, регуляторных Т-лимфоцитов, HLA- DR-положительных макрофагов, NK-клеток.

В клинической практике в качестве прогностических маркеров принято использовать определение уровней в сыворотке крови прокальцитонина, С-реактивного белка, ИЛ-6, ФНО-а, ИФН-у и т. д., но все они оказались недостаточно информативными.

Уровень прокальцитонина

Широкое распространение для диагностики ССВО, вызванного инфекцией, оценки тяжести и прогноза сепсиса получил метод определения уровня в сыворотке крови одного из прогормонов кальцитонина — прокальцитонина, который является медиатором системного воспаления.

В физиологических условиях прокальцитонин вырабатывается главным образом в нейроэндокринных клетках щитовидной железы (С-клетках) и легких. При тяжелой системной инфекции прокальцитонин образуется во многих клетках и тканях, включая лимфоциты и моноциты, и весь организм может рассматриваться как эндокринная железа.

Уровень прокальцитонина в сыворотке крови повышается при тяжелой генерализованной бактериальной, паразитарной и микотической инфекции. Локальные инфекции без системных проявлений, тяжелые генерализованные вирусные инфекции и ССВО неинфекционной этиологии вызывают лишь небольшое увеличение его уровня (от 0,3 до 1,5 нг/мл).

Уровень прокальцитонина коррелирует с тяжестью синдрома полиорганной недостаточности (оценивается по показателям SOFA), с клиническим состоянием пациента и поэтому служит для контроля течения заболевания. Кроме того, высокий уровень прокальцитонина отмечается достаточно рано (в пределах 3 часов от начала развития сепсиса).

Важно учитывать, что иногда повышение уровня прокальцитонина даже до 1000 нг/мл наблюдают у больных и при отсутствии сепсиса. Уровень прокальцитонина может повышаться у пациентов с тяжелыми травмами, ожогами, после хирургических операций, геморрагического шока, хотя его средние значения при этом обычно меньше, чем при тяжелом сепсисе и септическом шоке. Уровень прокальцитонина также нередко повышается при тяжелой пневмонии, перитоните, бактериальном менингите, малярии, мелиоидозе.

Таким образом, определение уровня прокальцитонина в сыворотке крови рекомендуется в следующих ситуациях:

• для диагностики сепсиса, септического шока и тяжелых бактериальных инфекций;
• для мониторинга состояния пациентов с сепсисом, шоком; оценки эффективности проводимого лечения; оценки прогноза для данного больного;
• для ранней диагностики инфекционных осложнений бактериальной и микотической этиологии после хирургических операций, трансплантации органов, у пациентов при интенсивной и иммуносупрессивной терапии, искусственной вентиляции легких, с нейтропенией и заболеваниями неясного генеза;
• для дифференциальной диагностики инфекционной и неинфекционной этиологии лихорадки неясного генеза, респираторного дистресс-синдрома, острого панкреатита, а также бактериальных и вирусных заболеваний (например, острого менингита, сепсиса новорожденных), острых бактериальных инфекций и аутоиммунных или иммунокомплексных болезней.

Этиология сепсиса

Сепсис полиэтиологичен. Тем не менее, основная роль принадлежит условно-патогенной бактериальной гноеродной флоре (стафилококк, стрептококк, пневмококки и т. д). Продолжаются дискуссии о возможности включения в число возбудителей сепсиса вирусов и грибов.

Генерализованные вирусные инфекции не принято рассматривать в качестве сепсиса, хотя об этом имеются указания в современных исследованиях. Не учитывают как сепсис тяжелое течение малярии и других паразитарных инвазий, а также инфекции, вызванные риккетсиями, хламидиями, микоплазмами.

Вопрос о возможности микотической этиологии сепсиса также дискутируется. В отдельных публикациях под микотическим сепсисом (кандидозная септицемия — В37.7) обычно подразумеваются кандемия и острый диссеминированный кандидоз, однако последний возникает, как правило, при очень тяжелом иммунодефиците, как, например, у ВИЧ-инфицированных пациентов в терминальных стадиях, больных онкологического профиля и при трансплантации органов в условиях иммуносупрессии.

В современных клинических классификациях инфекционных болезней указанные термины справедливо не употребляются. В этих случаях речь может идти о генерализованных формах заболеваний определенных нозологий, имеющих четко обозначенный возбудитель и требующих этиотропного лечения.

Сепсис есть примитивная общая реакция организма на инвазию инфекта, поскольку тканевые поражения при нем не имеют специфических признаков (например, специфических гранулем, как при ревматизме, сыпном тифе, туберкулезе и т. д.).

Известно, что кровь не может быть местом длительного обитания микроорганизмов, являясь для них лишь временной транспортной средой, и, чтобы выжить, возбудитель должен фиксироваться в тканях и органах, где он встретит подходящие условия для своего обитания и жизнедеятельности.

Сразу после фиксации микроба в органах и тканях возникает локальная клеточная воспалительная реакция, уже через 2—3 часа приводящая к формированию микроабсцесса, то есть развивается септикопиемия. Следует подчеркнуть и тот бесспорный факт, что способностью вызывать метастатические очаги в наибольшей мере обладают представители стрепто-, стафилококковой группы микроорганизмов, которые и являются в 95—98% случаев возбудителями септикопиемии.

В то же время представителям грамотрицательной бактериальной флоры более свойственно развитие местных резорбционно-токсических процессов и инфекционно-токсического шока. Тем самым подчеркивается значение этиологического фактора в специфике развития септических заболеваний.

Патогенез сепсиса

Для развития сепсиса необходимы определенные условия. Проникновение возбудителя через входные ворота (чаще травмированная кожа или слизистые оболочки) с развитием местной реакции (первичного аффекта) — септического очага.

Как правило, первичный аффект (септический очаг) совпадает с входными воротами, но иногда он возникает в отдаленных от места внедрения возбудителя тканях (например, гематогенный остеомиелит при внедрении инфекции через кожу).

Лимфогенное распространение инфекции ведет к развитию реактивного лимфангита, лимфотромбоза и лимфаденита. Регионарная лимфатическая система (структурная основа так называемого местного, или регионарного, иммунитета) является серьезным барьером для дальнейшего распространения инфекционного агента.

Расшифровка большой роли регионарной и общей лимфатических систем легла в основу специальных методов лечения (лимфотропная терапия, дренирование общего лимфатического протока и т. д.) инфекционно-воспалительных заболеваний и профилактики сепсиса.

Гематогенное распространение инфекции вызывает развитие гнойного флебита и тромбофлебита с последующим расплавлением тромбов и тромбо-бактериальной эмболией, бактериемией и токсемией. Поражение сосудистой стенки на большом протяжении приводит к образованию инфицированных микротромбов, развитию метастатических очагов, обусловливающих абсцессы и инфаркты внутренних органов.

Следует указать на два основных варианта образования гнойных метастазов. Первый развивается по следующей схеме: региональный тромбофлебит — тромбо-бактериальная эмболия — инфаркт — абсцесс органа. Второй заключается в предварительном развитии на фоне резорбционно- токсических процессов эндотелиальной дисфункции, токсических или токсико-аллергических васкулитов с последующей фиксацией на этих участках микроорганизмов в условиях бактериемии.

Примерно в 95—98% случаев это микробы стафило- стрептококковой группы, составляющие центральную зону метастатического очага и при смешанной кокко-бациллярной инфекции.

Грамотрицательная флора нередко присоединяется к первичной кокковой инвазии, гораздо реже возникают первичные колибациллярные и другие метастатические очаги при наличии определенных условий: токсико-аллергический васкулит, развивающийся инфаркт органа, некроз тканей в зоне инъекций и т. и.

Вместе с тем, по некоторым данным, микроорганизмы с высокими адгезивными свойствами могут сами прикрепляться к предварительно неизмененному эндотелию, затем, размножаясь, повреждают стенку сосуда, вызывая ее некроз с последующим развитием лейкоцитарного очажка.

Эпидемиологически и в зависимости от локализации входных ворот различают сепсис:

• нозокомиальный (внутрибольничный, госпитальный), хирургический, терапевтический, акушерский, ятрогенный (послеродовый, послеоперационный, посткатетеризационный, постинъекционный, после гинекологических осмотров), сепсис новорожденных (неонатальный, пупочный) и т. д.;
• криптогенный (при не выявленном септическом очаге), тонзилогенный, отогенный, одонтогенный, урогенный, генитальный, маточный, легочный, кишечный, абдоминальный раневой, ожоговый и т. д.

• тромбогеморрагический синдром (ДВС-синдром);
• септический (инфекционно-токсический) шок;
• полиорганный токсико-дистрофический;
• респираторный дистресс-синдром взрослых (РДСВ), развивающийся у 25—42% у пациентов с сепсисом.

РДСВ характеризуется альвеолярным и интерстициальным отеком, микроциркуляторными нарушениями с геморрагиями и интраальвеолярным выпадением фибрина с формированием гиалиновых мембран. Воспалительный инфильтрат минимален, в нем преобладают полиморфноядерные лейкоциты.

Взаимодействие перечисленных факторов, воздействие на организм возбудителей, их токсинов и продуктов распада тканей, всасывающихся в кровь из первичного и метастатических гнойных очагов, приводят к тяжелой интоксикации пациента, прогрессированию дистрофических и некротических изменений внутренних органов, нарушению функций всех систем гомеостаза и обусловливают клиническую картину заболевания.

Патологическая анатомия сепсиса

Различают местные и общие патоморфологические изменения.

Местные изменения чаще всего находят в месте внедрения инфекции — септический очаг (гнойное воспаление), лимфангит, лимфаденит, флебит и тромбофлебит. Реже входные ворота инфекции не совпадают с локализацией септического очага или септический очаг не обнаруживают (криптогенный сепсис).

Общие изменения при сепсисе характеризуются следующим.

• Дистрофические и некротические изменения паренхимы печени, почек, миокарда, мышц, ЦНС, а также РДСВ, которые лежат в основе СПОН.
• Воспаление, диффузное или очаговое межуточное (межуточный нефрит, гепатит, миокардит), продуктивные или продуктивно-некротические васкулиты. На клапанах сердца может развиваться острый бородавчатый эндокардит.
• Гиперплазия кроветворной и лимфоидной ткани (костного мозга, селезенки, лимфатических узлов).
• Бледность и желтушность кожи и склер (гемолитическая анемия и гемолитическая желтуха, впоследствии — смешанная, надпеченочная и печеночная), ДВС-синдром, петехиальная сыпь на коже и слизистых оболочках, кровоизлияния во внутренних органах, серозных оболочках.

А.А. Останин, О.Ю. Леплина, Е.Я. Шевела, Е.Р. Черных, В.И. Коненков

Гнойно-септические заболевания и осложнения представляют сферу исключительного внимания для хирургов самых разных специальностей в силу своей распространенности и высокого уровня летальности [2, 10, 21]. Как известно, возбудителем хирургических инфекций является условно-патогенная грамположительная и/или грамотрицательная микрофлора [1]. Бактериальные патогены выступают в роли триггера клеток иммунного реагирования, активация которых приводит к запуску сложного каскада цитокиновых взаимодействий, лежащих в основе развития врожденных (неспецифических) и приобретенных (специфических) реакций иммунитета. Механизмам естественной резистентности, которые являются одним из компонентов воспалительной реакции, отводят доминирующую роль в защите от условно-патогенной микрофлоры. При незначительном количестве возбудителя резерва тканевых, гуморальных и клеточных факторов, как правило, хватает для эффективной инактивации и элиминации патогена посредством его опсонизации и фагоцитоза. В случае массивной бактериальной контаминации или неэффективности локального ответа происходит диссеминация инфекции, что клинически манифестирует развитием генерализованного внутрисосудистого воспаления (сепсиса). Клиническая картина сепсиса многогранна, обусловлена токсическим поражением различных органов и тканей и может проявляться циркуляторными расстройствами, нарушениями свертывающей системы крови, кардио- и нефропатией, развитием токсического гепатита, неврологическими расстройствами и острой дыхательной недостаточностью [8]. Указанные дисфункции и нарушения лежат в основе синдрома полиорганной недостаточности (ПОН) [4, 14].

За последнее десятилетие представление о патогенезе сепсиса и ПОН существенно расширилось [5, 10, 12, 13]. Стало очевидным, что ответная реакция со стороны клеток иммунной системы на бактериальную агрессию носит двухфазный характер. Первая фаза сопряжена с продукцией провоспалительных цитокинов, участвующих в организации воспалительного ответа. Вторая обусловлена выбросом противовоспалительных медиаторов и направлена на ограничение воспаления. При этом чрезмерная выраженность или продолжительность той или иной фазы может негативно сказываться на течении и исходе заболевания. Так, например, считается, что избыточная продукция провоспалительных цитокинов может индуцировать развитие шока, тогда как пролонгированные противовоспалительные реакции сопряжены с формированием глубокой иммунодепрессии, что во многом предопределяет летальный исход на поздних этапах гнойно-септического процесса.

Следует отметить, что бимодальная концепция течения септического процесса опирается преимущественно на данные экспериментальных исследований и теоретические представления о закономерностях развития системной воспалительной реакции [12, 13]. В то же время практически полностью отсутствуют прямые доказательства взаимосвязи между характером изменений цитокинового баланса и клиническими особенностями сепсиса, в частности, связанными с манифестацией шока или формированием полиорганных нарушений. До последнего времени такая ситуация являлась объективной и во многом была обусловлена уровнем развития лабораторно-диагностической базы исследований. Понятно, что для корректной оценки состояния цитокинового баланса требуется одномоментная оценка содержания нескольких цитокинов из оппозитных подгрупп (Th1 и Th2, про- и противовоспалительных цитокинов). Определение концентрации в крови какого-то одного из них, например TNFa или IL-4, может оказаться недостаточно информативным.

В современных условиях наметился определенный прорыв в области диагностической медицины, который связан с разработкой и внедрением в практику автоматизированного анализатора нового поколения производства компании Bio-Rad (USA). Предложенная технология позволяет проводить количественное исследование до 100 различных белков и пептидов в одном тестируемом образце [15]. В частности, в настоящее время разработаны коммерческие тест-системы для определения 17 цитокинов, относящихся к различным, функционально значимым группам. Создание диагностических систем, позволяющих осуществить множественный анализ параметров цитокинового статуса человека, открывает определенные перспективы в изучении сложного каскада цитокиновых взаимодействий, вовлеченных в развитие большинства патофизиологических процессов.

Целью настоящей работы явилась интегральная оценка сывороточного уровня Th1 и Th2, про- и противовоспалительных цитокинов, хемокинов у хирургических больных с тяжелым сепсисом/ПОН, а также при клинической манифестации септического шока.

В исследование были включены 14 больных с хирургическим сепсисом (57 % мужчин и 43 % женщин, средний возраст 49,6 + 4,0 лет), находящихся в отделении реанимации и интенсивной терапии (ОРИТ). При этом 86 % (12/14) пациентов были обследованы в раннем послеоперационном периоде (в среднем на 3-и сут) и двое больных - в более поздние сроки (на 7-е и 10-е сут). В сформированной группе у 5 пациентов регистрировали абдоминальный и у 3 - раневой сепсис. Кроме того, было обследовано 6 больных с гнойно-деструктивными заболеваниями бронхолегочного аппарата (абсцедирующая пневмония, пиопневмоторакс) и средостения (медиастенит).

У подавляющего большинства больных (93 %, 13/14) регистрировался эндотоксикоз тяжелой или крайне тяжелой степени. При этом в целом по группе отмечался выраженный лейкоцитоз (20,0 + 2,5 _ 109/л), значительное увеличение скорости оседания эритроцитов (СОЭ) (45,2 + 3,5 мм/ч) и лейкоцитарного индекса интоксикации (ЛИИ) (7,9 + 1,5 расч. ед.).

Диагноз тяжелого сепсиса определяли в соответствии с рекомендациями Чикагской согласительной конференции [11] по следующим критериям: 1) наличие очага инфекции; 2) клиническая манифестация синдрома системного воспалительного ответа (SIRS); 3) наличие синдрома полиорганной недостаточности. Степень тяжести больных определяли по шкалам APACHE-II и SAPS [19, 20]. В первом случае средний балл составил 17,7 + 2,1 баллов, во втором - 13,2 + 1,2 баллов, что позволяло прогнозировать вероятную летальность на уровне 30 %. Для оценки тяжести полиорганной недостаточности использовали шкалу SOFA [3], при этом средний балл в целом по группе составил 7,3 + 1,1. В структуре органных дисфункций чаще других регистрировались дыхательная недостаточность (86 % случаев), дисфункция ЦНС (78 %), сердечно-сосудистая недостаточность (43 %) и относительно реже почечная и печеночная дисфункции (35,5 и 7,5 % случаев соответственно). В группе больных, вошедших в исследование, 6 человек было обследовано на пике клинической манифестации септического шока.

В послеоперационном периоде, в условиях ОРИТ, всем больным проводилась антибактериальная терапия (с использованием карбапенемов, цефалоспоринов IV поколения, аминогликозидов II поколения, фторхинолонов), а также комплексная интенсивная терапия в необходимом объеме.

При проведении иммунологических исследований из венозной цельной или гепаринизированной крови выделяли стандартными методами лейковзвесь, сыворотку, мононуклеарные клетки (МНК). МНК в концентрации 0,1 _ 106/лунку культивировали в 96-луночных круглодонных планшетах в полной культуральной среде RPMI-1640 (Sigma, USA) при 37 °С в СО2-инкубаторе. Для стимуляции клеток использовали конканавалин А (КонA, 15 мкг/мл, Sigma) и растворимые моноклональные анти-CD3 антитела (анти-CD3-мАТ ICO-90) ("Медбиоспектр", Москва) в концентрации 1 мкг/мл. Интенсивность пролиферации оценивали через 72 ч после включения 3Н-тимидина (1 мкКи/лунку).

Методом проточной цитофлюориметрии (FACS Calibur, Becton Dickinson), используя соответствующие моноклональные антитела ("Сорбент-сервис", Москва), определяли содержание различных субпопуляций лимфоцитов (CD3+, CD4+ и СD8+ Т-лимфоцитов, CD20+ В-лимфоцитов, CD16+ NK-клеток), а также относительное количество моноцитов, высокоэкспрессирующих HLA-DR антигены, и средний уровень экспрессии (mean fluorescence, MF) HLA-DR-молекул на моноцитах.

Методом проточной цитофлюориметрии среди свежевыделенных клеток лейковзвеси определяли также процентное содержание апоптотических лимфоцитов, нейтрофилов и моноцитов, которые вследствие фрагментации ДНК формируют характерный гиподиплоидный пик при окрашивании йодидом пропидия (50 мкг/мл) (Sigma, USA).

Наличие в сыворотке больных иммуносупрессорной активности оценивали по степени снижения КонА-индуцированной пролиферации МНК здоровых доноров (n = 2-3) при содержании 10 % интактной сыворотки больных (опыт - О) по сравнению с уровнем ответа при содержании 10 % интактной сыворотки доноров (контроль - К). При этом рассчитывали индекс супрессорной активности (ИСА) по следующей формуле: ИСА = О-К.

О суммарной активности эндогенных медиаторов воспаления в сыворотке больных судили по величине индекса воспалительной активности (ИВА). Сущность метода заключается в том, что в лейковзвеси здоровых доноров (n = 2-3), инкубированной в течение 45 мин с интактной сывороткой больных (опыт) или доноров (контроль) в объемном соотношении 1 : 1, определяют активность нейтрофилов по продукции перекиси водорода (Н2О2). ИВА высчитывают по формуле: ИВА = О-К.

Содержание в сыворотке крови 17 цитокинов (IL-1b, TNFa, IFNg, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12 (p70), IL-13, IL-17, G-CSF, GM-CSF, МСР-1, MIP-1b) оценивали методом проточной флюориметрии на 2-лучевом лазерном автоматизированном анализаторе (Bio-Plex Protein Assay System, Bio-Rad, USA) с использованием коммерческих тест-систем 17-Plex (определяемый динамический диапазон 2-32000 пкг/мл) в соответствии с инструкцией фирмы-производителя*. Метод основан на специфическом связывании исследуемых цитокинов с твердой фазой, которая представляет собой суспензию полистироловых гранул размером 5,5 мкм. Одновременно в анализе используется 17 типов гранул, каждый из которых различается собственной флюоресцентной меткой и конъюгирован с соответствующими моноклональными антицитокиновыми антителами. После специфического связывания гранул с цитокинами, содержащимися в исследуемых образцах сыворотки и в калибровочных пробах с известным их количеством, в реакционную смесь добавляют антицитокиновые антитела, конъюгированные с биотином. Для детекции образовавшейся "сэндвич-структуры" используют взаимодействие биотина со стрептавидином, меченным "репортерной" флюоресцентной меткой (фикоэритрином). Постановка всех реакций происходит в 96-луночном планшетном формате. Оценка результатов проводится на проточном флюориметре, где гранулы автоматически разделяются по типам с использованием их собственных FITC-меток, а количество связавшихся с ними цитокинов оценивается по суммарной интенсивности флюоресценции фикоэритрина. С помощью стандартных калибровочных разведений концентрация исследуемых 17 цитокинов в тестируемых образцах сыворотки высчитывается автоматически на персональном компьютере с использованием программы "Bio-Plex Manager".

Дополнительно оценивали сывороточный уровень рецепторного антагониста IL-1 (IL-1Ra) методом иммуноферментного анализа (тест-системы производства ООО "Цитокин", Санкт-Петербург, определяемый динамический диапазон 150-2500 пкг/мл). Кроме того, оценивали уровень общей фракции IL-10 (в свободной и связанной форме) с помощью иммуноферментных тест-систем "Accucyte Human IL-10" (Cytimmune Inc., USA, определяемый динамический диапазон 0,195-200 нг/мл).

Математическую обработку полученных результатов проводили на персональном компьютере с использованием пакета программ "STATISTICA 5,0". Таблицы содержат информацию в виде средних арифметических величин (М) и стандартных ошибок средних (SE). Сравнение вариационных рядов осуществляли с помощью непараметрического U-критерия Вилкоксона - Манна - Уитни. Корреляционный анализ проводили методом ранговой корреляции по Спирману.